|
Detail produk:
|
| Nama Produk: | qPCR | Suhu Penyimpanan: | –20 °C |
|---|---|---|---|
| Kuat dan aktif untuk sintesis cDNA: | hingga 55 °C. | Aplikasi: | PCR |
| Volume: | 1ml | Transkripsi terbalik: | kisaran suhu (42-60 ° C) |
| Cahaya Tinggi: | Universal TaqMan Multiplex QPCR,Reagen Biokimia TaqMan Multiplex QPCR,1ml TaqMan Multiplex QPCR |
||
Campuran master qPCR multipleks universal TaqMan
Prinsip desain primer:
1. Panjang produk amplifikasi direkomendasikan antara 80-300 bp;
2. Panjang primer: 18-25 bp;
3. Kandungan basa G+C dalam primer harus antara 40%-60%;
4. Perbedaan nilai Tm antara primer maju dan primer mundur kurang dari 2℃, dan nilai Tm antara 58-62℃ adalah yang terbaik;
5. Keacakan distribusi basis;
6. Primer sebaiknya tidak mengandung urutan pelengkap sendiri, jika tidak mereka akan membentuk struktur jepit rambut sekunder;
7. Tidak boleh ada lebih dari 4 basa komplementer atau homolog antara dua primer, jika tidak akan terbentuk dimer primer, terutama tumpang tindih komplementer pada ujung 3';
8. Basis terminal 3' dari primer disarankan sebagai G atau C;
9. Tidak ada produk non-spesifik lainnya yang ditemukan dalam hasil perbandingan NCBI.
Pengenalan master mix universal TaqMan multipleks qPCR:
Produk ini merupakan larutan premix 2x untuk qPCR menggunakan metode fluoresensi chimeric GSK Green I.Komponen inti, Taq DNA Polymerase, adalah DNA Polymerase yang diaktifkan panas yang diblokir dengan metode antibodi, yang secara efektif dapat menghambat amplifikasi nonspesifik dalam kondisi suhu rendah.Sementara itu, dikombinasikan dengan Buffer reaksi yang dioptimalkan untuk qPCR, Taq DNA Polymerase sangat cocok untuk reaksi qPCR dengan spesifisitas dan sensitivitas tinggi.Kurva standar yang baik dapat diperoleh di area kuantitatif yang luas, yang akurat, dapat direproduksi dan dapat diandalkan untuk analisis kuantitatif gen target.Pada saat yang sama, produk ini mengandung Pewarna Referensi Pasif ROX khusus yang cocok untuk digunakan di semua instrumen qPCR, dan tidak perlu menyesuaikan konsentrasi ROX pada instrumen yang berbeda.Pewarna biru ditambahkan dalam premix, yang memiliki efek pelacak menambahkan sampel, dan pengencer template kuning disediakan pada waktu yang sama.Ketika template diencerkan dengan pengencer template kuning dan ditambahkan ke dalam premiks reaksi biru, warna berubah dari biru menjadi hijau, yang dapat memainkan peran pelacak dalam persiapan proses sistem reaksi dan mencegah kebocoran atau kesalahan penambahan.Spektrum pewarna biru dan kuning tidak tumpang tindih dengan pewarna qPCR dan tidak mempengaruhi hasil reaksi.
Protokol / Prosedur Pengujian tentangCampuran master qPCR multipleks universal TaqMan:
1. (Opsional) pengenceran template :
Kit ini menyediakan 40x YELLOW Template Dilution Buffer, 40 kali diencerkan Yellow Template Dilution yang dapat digunakan untuk menentukan secara akurat apakah Template telah ditambahkan ke cairan reaksi qPCR dengan mengubah warna cairan.Mengambil sistem reaksi qPCR 20ul sebagai contoh, sesuai dengan jumlah template pengenceran yang ditambahkan ke dalam larutan reaksi qPCR 20ul, metode pengenceran yang sesuai dari template asli dapat dirujuk ke tabel berikut (mengambil template asli yang diencerkan hingga 100ul sebagai contoh ):
| Tambahkan template encer ke larutan reaksi qPCR 20ul(ul) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| Tambahkan Penyangga Pengenceran Template KUNING 40x ke Sistem Pengenceran Template 100ul(ul) | 50 | 25 | 16.7 | 12.5 | 10 | 8.4 | 7.2 | 6.3 |
| Tambahkan Sistem Pengenceran Template 100ul ke template utama (ul) | x | x | x | x | x | x | x | x |
| volume penambahan Nuklease - Air Bebas(ul) | 50-x | 75-x | 83,3-x | 87,5-x | 90-x | 91,6-x | 92,8-x | 93,7-x |
Contoh:
Template encer 2ul harus ditambahkan ke sistem reaksi qPCR 20ul.
Mengambil sistem 100ul Template Dilution sebagai contoh, ketika volume Template asli adalah 20ul, 25ul 40x Yellow Template Dilution Buffer ditambahkan, dan kemudian Air bebas Nukleus 55ul ditambahkan ke total volume 100ul.
BUFFER PENGENCAN TEMPLATE KUNING 40x sekarang menjadi 10x.Tambahkan 2ul Template yang diencerkan ke dalam Penyangga Pengenceran 20ul, dan Penyangga Pengenceran Template KUNING 40× terakhir adalah 1x.Kesimpulannya, Yellow Template Dilution Buffer harus 1x dalam sistem qPCR akhir.
Informasi Produk dari Universal TaqMan multiplex qPCR master mix :
| Nama Produk | Identifikasi produk | Model |
| Campuran master qPCR multipleks universal TaqMan | GS-MBP0044-01 | 1ml |
| GS-MBP0044-05 | 5×1 mL | |
| GS-MBP0044-15 | 15×1 mL |
Kondisi Penyimpanan dan Penanganan dengan master mix qPCR multipleks Universal TaqMan:
Transportasi kantong es basah;Disimpan pada suhu -20℃, berlaku selama 12 bulan.
Catatan:Jika template tidak perlu diencerkan, atau jika pengencer template G3362-2 tidak digunakan, Anda dapat mengabaikan langkah ini.
2.Prosedur reaksi PCR (dapat disesuaikan dengan instrumen) :
a: Jika spesifisitas amplifikasi perlu ditingkatkan, prosedur dua langkah atau suhu anil dapat digunakan;Untuk meningkatkan efisiensi amplifikasi, prosedur tiga langkah atau waktu perpanjangan dapat digunakan.
Catatan:
1. Harap kenakan sarung tangan sekali pakai selama operasi untuk menghindari kontaminasi RNase.
2. Produk transkripsi terbalik dapat disimpan pada -20℃ untuk waktu yang singkat.Jika penyimpanan jangka panjang diperlukan, disarankan untuk menyimpannya pada suhu -80℃ setelah pengemasan untuk menghindari siklus beku-cair berulang.
3. Jika template berasal dari eukariotik, direkomendasikan untuk memilih Oligo (dT)18 Primer dan memasangkannya dengan 3' Poly A tail mRNA eukariotik untuk mendapatkan hasil cDNA full-length tertinggi.
4. Untuk transkripsi balik RNA prokariotik, sebaiknya digunakan Random Hexamer Primer atau Gene Specific Primer.
5. Random Hexamer Primer memiliki penerapan yang luas dan cocok untuk mRNA, rRNA, tRNA, RNA kecil dan lncRNA template.
6. Jika transkripsi terbalik diikuti oleh uji qPCR, Oligo (dT)18 Primer dan Random Hexamer Primer dapat dicampur untuk membuat efisiensi sintesis cDNA di semua wilayah mRNA sama, yang membantu meningkatkan keaslian dan pengulangan hasil kuantitatif.
7. Jika primer qPCR berikutnya dirancang melintasi ekson, langkah penghapusan genom dapat dihilangkan.
Masalah umum dan solusi:
| Deskripsi masalah | Kemungkinan alasan | Solusi |
| Pada akhir reaksi, tidak ada kurva amplifikasi yang muncul atau nilai CT muncul terlambat | Konsentrasi template terlalu rendah | Ulangi percobaan untuk mengurangi kelipatan pengenceran template, dan mulai dari konsentrasi tertinggi ketika konsentrasi sampel tidak diketahui |
| Degradasi template | Template disiapkan lagi dan percobaan diulang | |
| Ada inhibitor PCR dalam sistem | Umumnya, template dibawa masuk, rasio pengenceran template ditingkatkan atau template dengan kemurnian tinggi dibuat ulang dan diulang. | |
| Primer dapat terdegradasi | Primer yang sudah lama tidak digunakan harus terlebih dahulu diuji integritasnya dengan elektroforesis PAGE untuk mengesampingkan kemungkinan degradasi. | |
| Efisiensi amplifikasi rendah | tingkatkan konsentrasi primer, coba prosedur amplifikasi tiga langkah, atau rancang ulang primer | |
| Produk amplifikasi terlalu panjang | Panjang produk amplifikasi dikendalikan dalam kisaran 80-300 bp | |
| Kontrol kosong menunjukkan sinyal | Polusi sistem reaksi | Pertama, air kontrol kosong harus diganti.Jika situasi yang sama masih terjadi, primer, aspirator dan tabung PCR harus diganti atau Master Mix baru harus dimulai.Sistem reaksi disiapkan dalam tabel yang sangat bersih untuk mengurangi polusi aerosol |
| Amplifikasi non-spesifik seperti dimer primer muncul |
Umumnya, adalah normal untuk produk amplifikasi muncul dalam kontrol kosong setelah 35 siklus, yang harus dianalisis dengan kurva leleh. Mendesain ulang primer, menyesuaikan konsentrasi primer atau mengoptimalkan prosedur reaksi PCR |
|
| Kurva leleh memiliki beberapa puncak | Desain primernya buruk | Primer baru dirancang ulang sesuai dengan prinsip desain primer |
| Konsentrasi primer terlalu tinggi | Kurangi konsentrasi primer dengan tepat | |
| Ada kontaminasi genom dalam template cDNA | Solusi RNA yang diekstraksi dicerna menggunakan enzim DNA, seperti DSDNase, untuk menghilangkan kontaminasi genom, atau untuk merancang primer transintron | |
| Reproduksibilitas eksperimen yang buruk | Kesalahan menambahkan sampel besar |
Penggunaan pipet akurat, dengan pipet akurat kepala hisap berkualitas tinggi; Template pengenceran tinggi, menambahkan template volume besar untuk mengurangi kesalahan pengambilan sampel; Volume reaksi qPCR diperbesar |
| Konsentrasi template terlalu rendah | Ulangi percobaan untuk mengurangi waktu pengenceran template | |
| Penyimpangan suhu di berbagai lokasi instrumen qPCR | Kalibrasi instrumen qPCR secara teratur | |
| Kurva amplifikasi tidak mulus | Sinyal fluoresensi terlalu lemah, dihasilkan setelah koreksi sistem |
Pastikan bahwa pewarna yang dicampur dalam Master Mix tidak terdegradasi; Ganti sinyal fluoresen untuk mengumpulkan bahan habis pakai qPCR yang lebih baik |
| Kurva amplifikasi putus atau tergelincir | Konsentrasi template lebih tinggi dan nilai titik akhir awal lebih besar dari nilai CT | Titik akhir dasar (nilai Ct -3) dikurangi dan data dianalisis ulang |
| Kurva amplifikasi Sumur individu tiba-tiba turun tajam | Ada gelembung di tabung reaksi |
Pastikan CAMPURAN benar-benar larut, dan jangan berputar dan berosilasi secara merata; Setelah sampel ditambahkan, gelembung dihilangkan dengan sentrifugasi dengan elastis ringan. Waktu pra-denaturasi diperpanjang hingga 10 menit untuk menghilangkan gelembung |
Jika Anda memerlukan info lebih lanjut tentang master mix qPCR multipleks Universal TaqMan, beri tahu kami secara online, terima kasih.
Kontak Person: Ms Kris
Tel: +8613049739311
